二、TOPO克隆PCR产物的纯化回收

1. PCR反应结束后，需进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认是否存在目标大小的条带。

2. 推荐采用切胶回收法进行纯化，切胶时间最好控制在3分钟内，避免紫外照射对DNA造成的损伤。回收后的浓度应使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测，浓度应达到≥30ng/μl，并通过跑胶进一步确认是否仅存在目标条带。

3. 将目标片段连接至载体：

1) 按照说明书要求投入连接反应体系，各组分体积应≥1μl，如果浓度过高，可进行稀释后使用；

2) 尝试在25°C或37°C下进行连接反应，时间设置为5分钟，如果出现克隆失败或假阳性，可以尝试将时间延长至30分钟。

4. 感受态细胞转化与涂板：

1) 选择DH5α或Fast-T1等克隆用化学感受态细胞进行连接产物的转化；

2) 感受态细胞不应重复冻融使用，建议-80°C取出后一次性使用；

3) 重组产物与感受态细胞的体积比例为1:10，推荐10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，或5μl重组产物加入到50μl感受态细胞中；

4) 热激时间应按照感受态细胞说明书进行操作；

5) 平板使用的抗生素抗性需与转化载体的抗性保持一致；

6) 将菌液离心（2500×g，3分钟），吸去多余的LB培养基，保留100μl重悬液后全部涂板，或根据需要吸取合适体积涂板。

5. 单克隆菌落的PCR鉴定：

1) 从平板中挑取适中大小的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落；

2) 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析；

3) 将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中溶解混匀后，吸取1-2μl作为PCR反应的模板（10/20μl体系）；

4) 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

需要注意，如果模板中存在Amp/kana抗性的质粒，需对目的片段进行切胶回收。

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